免疫印迹膜剥离和重新检测

免疫印迹膜剥离和重新检测

 

免疫印迹是研究蛋白质功能和定位的常用技术。通常，蛋白质样品可在SDS-PAGE上分离并转印至硝酸纤维素膜(NC膜)或PVDF膜上，然后用特异性抗体进行检测。与可重复利用Southern和Northern印迹的核酸技术不同，免疫印迹很难重复使用。

 

免疫印迹的剥离和重新检测技术具有以下几个优点：

1.有利于昂贵或量少或珍稀样本的多次杂交；

2.有利于用不同抗体分析单次印迹上的不同蛋白，比如不同亚型的抗体；

3.有利于对异常结果进行重分析或确认；

4.有利于纠正孵错的抗体；

5节约试剂成本，并节约时间。

 

目前已经公布了几种用于从免疫印迹上剥离抗体的方案，包括低pH、加热和去垢剂以及离液剂等方法。以下是三种推荐方案。第一种方案适用于任何化学发光底物系统，即通过加热和去垢剂的组合来解离抗体。第二种常用于抗体必须与抗原分离的应用，即采用低pH值来改变抗体的结构，使结合位点失活。

第三种方案利用具有特殊配方的Western Blot Stripping Buffer（蛋白质印迹剥离缓冲液）从免疫印迹膜上剥离抗体。该方法的优势在于：

• 避免吸入与β-巯基乙醇有关的刺激性气味。

• 可在室温条件下处理。

• 可在15分钟内剥离抗体。

这些方法都不能去除显色检测系统所产生的有色沉淀（如BCIP、4CN、DAB和TMB）。但是，仍可以利用靶向不同目标蛋白的另一种抗体来分析印迹。

通常，这些方案仅能用于定性用途，除非已经确定剥离过程不会影响指定抗原的定量结果。许多抗原将经历至少5次剥离循环，具体取决于所用的方法和膜类型。但是，应该考虑到在每个剥离循环中，都将洗去少量的膜固定蛋白。如果需要连续检测几种抗原，建议从预期丰度较低或产生信号较少的抗原开始。

 

在设计具有一轮或多轮抗体剥离的免疫印迹实验时，可参考以下建议。

• PVDF膜比硝酸纤维素膜更坚韧，因此推荐用于任何涉及抗体剥离的方案。

• 从SDS-PAGE凝胶转印完成后立即干燥PVDF膜，可改善蛋白质与膜的结合，特别推荐用于涉及多次剥离的实验。在第一轮免疫检测之前，必须使用乙醇将干燥的PVDF膜润湿。

• 优先检测低丰度抗原。

• 先使用亲和力低的抗体，再使用高亲和力抗体。

重要提示：尽管建议在转印后立即干燥PVDF印迹，但不可在两轮免疫检测之间干燥印迹，否则，任何残留的抗体分子将与膜永久结合。

 

方案1：通过加热和去污剂剥离

所需设备和溶液

• 标准印迹或印迹条，在硝酸纤维素或PVDF膜上。

• 封闭液。

• 剥离溶液：100 mM 2-巯基乙醇 (M301574)、2% (w/v) SDS (S108346)、62.5 mM Tris-HCl (T105291), pH 6.7。

• 磷酸盐缓冲盐（PBS）：10 mM 磷酸钠、pH 7.2，0.9%（w/v）NaCl。

• 浅托盘，能容纳膜

• 阳性和阴性剥离对照。

操作流程

1.在通风橱内，将印迹放入剥离溶液中，50 °C摇动孵育30分钟。

2.将印迹放入缓冲液中，摇动10分钟。使用新鲜的缓冲液重复一次。

3.可选: 重复初始检测操作（省略一抗步骤），

4.以确保抗体已失活或从膜上剥离。

5.将印迹放入缓冲液中，摇动10分钟。

6.继续进行封闭步骤，进行下一轮的免疫检测。

 

方案2：通过低PH值剥离

所需设备和溶液

• 标准印迹或印迹条，在硝酸纤维素或PVDF膜上。

• 封闭液。

• 剥离溶液：25 mM 甘氨酸-HCl (G156794), pH 2,1% (w/v) SDS (S108346)。

• 磷酸盐缓冲盐（PBS）：10 mM 磷酸钠、pH 7.2，0.9%（w/v）NaCl。

• 浅托盘，能容纳膜

• 阳性和阴性剥离对照。

操作流程

1.将印迹放入剥离溶液中，摇动孵育30分钟。

2.将印迹放入缓冲液中，摇动10分钟。使用新鲜的缓冲液重复一次。

3.继续进行封闭步骤，进行下一轮的免疫检测。

 

方案3：利用WESTERN BLOT STRIPPING BUFFER（蛋白质印迹剥离缓冲液）

抗体剥离液对硝酸纤维素和PVDF膜均具有良好的剥离效果。但在待剥离膜具有较高信号或抗体剥离液体处理不充分时效果更好。

所需设备和溶液

• 标准印迹或印迹条，在硝酸纤维素或PVDF膜上。

• 封闭液。

• 保鲜膜，用于保存不会立即再次检测的印迹。

• Western Blot Stripping Buffer（蛋白质印迹剥离缓冲液）

• 蒸馏水，用于稀释试剂。

• 浅托盘，能容纳膜

• 阳性和阴性剥离对照。

操作流程

注意：若要重复使用印迹或单个印迹条，应在第一次使用后立即剥离。如果不能立即剥离，应将膜包在保鲜膜中并置于PBS中，保存在4°C。切勿将印迹干燥保存。

1.在塑料托盘中加入适量的1X Antibody Stripping Solution（缓冲液套餐中提供）

2.用镊子将印迹或印迹条浸入剥离液中。在室温下，轻轻混合孵育15分钟。在一个干净的塑料托盘中装入相同量的封闭液。

3.可使用传统的封闭液，如20 mM Tris HCL、pH 8.0，150 mM NaCl，0.1% 吐温20，5%奶粉，或者类似溶液。

4.使用封闭液清洗印迹2次，每次5分钟。

5.现在，可使用抗体再次检测印迹。

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参考文献

1.Lioubin MN, Myles GM, Carlberg K, Bowtell D, Rohrschneider LR. 1994. Shc, Grb2, Sos1, and a 150-kilodalton tyrosine-phosphorylated protein form complexes with Fms in hematopoietic cells.. Mol. Cell. Biol.. 14(9):5682-5691. http://dx.doi.org/10.1128/mcb.14.9.5682

2.Legocki RP, Verma DPS. 1981. Multiple immunoreplica technique: Screening for specific proteins with a series of different antibodies using one polyacrylamide gel. Analytical Biochemistry. 111(2):385-392. http://dx.doi.org/10.1016/0003-2697(81)90577-7

3.Harlow E, Lane D. 1988. A Laboratory Manual. 579. New York: Cold Spring Harbor Laboratory.

4.Kaufmann SH, Ewing CM, Shaper JH. 1987. The erasable Western blot. Analytical Biochemistry. 161(1):89-95. http://dx.doi.org/10.1016/0003-2697(87)90656-7

5.Yeung Y, Stanley ER. 2009. A solution for stripping antibodies from polyvinylidene fluoride immunoblots for multiple reprobing. Analytical Biochemistry. 389(1):89-91. http://dx.doi.org/10.1016/j.ab.2009.03.017

 

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